postheadericon Wykrywanie kwasów nukleinowych

Poznane fragmenty kwasów nukleinowych można zsyntetyzować w potrzebnej ilości in vitro, a następnie wyznakować za pomocą radioaktywnego izotopu, enzymu lub fluorochromu, uzyskując tzw. sondę genetyczną. Zasada użycia sondy do celów diagnostycznych polega na uprzednim wyekstrahowaniu kwasu nukleinowego z próbki pobranego materiału, np. z krwi pacjenta podejrzanego o zimnicę, nakro- pieniu ekstraktu na filtr nitrocelulozowy i zdenaturowaniu przez ogrzewanie. W czasie ogrzewania nici denaturowanego kwasu prostują się i rozdzielają, zachowując jednak właściwości wiązania kwasu nukleinowego o komplementarnej sekwencji nukleotydów. Jeżeli w badanej próbce znajduje się kwas nukleinowy, którego fragmenty odpowiadają sekwencji nukleotydów użytej sondy genetycznej, to sonda zostanie związana na filtrze, co można wykazać metodą autoradiograficzną lub przez dodanie substratu stosownego do enzymu użytego jako znacznika sondy (ryc. 2.4). Im częściej sekwencja nukleotydów komplementarnych do sekwencji w użytej sondzie powtarza się w cząsteczkach badanego materiału, tym łatwiej dochodzi do związania sondy i tym większa czułość metody.

Inny sposób wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą sondy genetycznej opiera się na opłaszczaniu fazy stałej sondą wychwytującą z badanego materiału po-szukiwany kwas nukleinowy, którego obecność można następnie wykazać za pomocą drugiej sondy sprzężonej ze znacznikiem.

Ponieważ reakcja wiązania sondy zachodzi wielokrotnie szybciej w środowisku płynnym niż na fazie stałej, zdecydowano się opracować metody wykorzystujące to zjawisko do diagnostyki DNA. We wspomnianych metodach powstające kompleksy

Zastosowanie sondy genetycznej oferuje nie znane dotąd możliwości diagno-styczne, np. szansę wykrycia DNA Plasmodium w próbce krwi o objętości 0,05 cm3, w której 1 zarażona krwinka przypada na 100 000 zdrowych, lub DNA Brugia ma- layi, pochodzącego z zaledwie 5 mikrofilarii pasożyta.

Bardziej zawrotną karierę diagnostyczną zrobiły metody umożliwiające amplifi- kację kwasu nukleinowego w próbce badanego materiału, spośród których najpopu-

Leave a Reply